免疫電鏡技術（immunoelectron microscopy，IEM）又稱為免疫細胞化學技術，是在免疫組織化學技術（immunohistochemistry）的基礎上發(fā)展起來的，它是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量抗原的技術方法。該方法為精確定位各種抗原的存在部位、研究細胞結(jié)構(gòu)與功能的關系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段。免疫電鏡技術主要經(jīng)歷了鐵蛋白標記技術、酶標記技術以及膠體金標記技術三個主要發(fā)展階段。
??? 鐵蛋白標記技術適用于細胞膜表面抗原的定位，由于其分子量較大，不易穿透細胞膜，定位細胞內(nèi)抗原較為困難。鐵蛋白對電鏡包埋劑的非特異性吸附很強，不適用于包埋后免疫標記，使其應用受到一定限制。
??? 酶標記免疫電鏡技術是將酶（主要是過氧化物酶）與抗體相交聯(lián)，抗原抗體反應后，加底物顯示酶的活性部位，酶反應產(chǎn)物經(jīng)OsO4處理變?yōu)榫哂幸欢娮用芏鹊匿~黑，可在電鏡下觀察。過氧化物酶的相對分子量較小，與其交聯(lián)的抗體較易穿透經(jīng)處理的細胞膜，可用于細胞內(nèi)抗原的定位。但是酶反應產(chǎn)物比較彌散，因此分辨率不如顆粒性標記物高。
??? 膠體金標記免疫電鏡技術是目前應用最廣的免疫電鏡標記物，該技術是將膠體金作為抗體的標記物，用于細胞表面和細胞內(nèi)多種抗原的精確定位。膠體金主要具有以下幾個優(yōu)點：（1）膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯改變，可制備抗體-膠體金、蛋白A-膠體金、卵白素-膠體金、植物凝集素-膠體金等用于免疫電鏡；（2）在電鏡下金顆粒電子密度高、圓形且界線清晰，易于辨認，定位比酶反應物更精確；（3）膠體金標記物易于制備，并可以根據(jù)需要制備大小不同（1～150nm）的膠體金，因此可進行免疫電鏡的雙重或多重標記；（4）金顆粒能發(fā)射強烈的二次電子，是掃描電鏡的理想標記物；（5）膠體金經(jīng)過銀顯影增強后，金顆粒外周吸附大量銀顆粒而呈現(xiàn)黑色或黑褐色，因此也能用于光學顯微鏡觀察。此外，膠體金還能用于冷凍蝕刻標本的? 免疫標記。
????抗體的制備，標本的處理，免疫標記，對照實驗、結(jié)果的觀察和解析。
??? 抗體的制備
??? 特異性高、親和力強的高效價抗體是獲得理想的免疫標記結(jié)果的首要條件要?？贵w可購買或自己制備。大分子完全抗原，可直接免疫動物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠來獲得抗體。半抗原，用偶聯(lián)劑使半抗原與大分子物質(zhì)結(jié)合成復合物，再去免疫動物產(chǎn)生抗體，大分子物質(zhì)稱為載體蛋白，以甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白或血藍蛋白最為常用。偶聯(lián)劑為戊二醛或碳二酰亞胺等。目前細胞雜交瘤技術制備的單克隆抗體最為理想。
??? 標本的處理
??? 為了既能將抗原準確定位甚至定量，又能觀察到近似于生活狀態(tài)下的細胞超微結(jié)構(gòu)，必須選擇合適的固定劑，慎重處理樣品。
??? 取材
??? 單細胞：培養(yǎng)細胞或血細胞應隨用隨取。懸浮培養(yǎng)細胞可先離心（800 rpm，5 min），用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗1次后進行固定。貼壁細胞則可先將其培養(yǎng)在玻片上，用PBS輕輕沖洗后立即固定，也可用胰酶將細胞消化下來，按懸浮培養(yǎng)細胞的制備方法制備。
組織：取組織塊時做到越快越好，最好在沒有停止血流前就取材。若觀察的對象為肺、大腦、脊髓或內(nèi)分泌器官等比較柔軟的組織，應先做灌注固定，再用銳利的刀片將其切成約2 mm×2 mm×l mm大小的組織塊，切時要避免擠壓與牽拉，然后投入到固定液中繼續(xù)固定。
??? 固定?
??? 固定劑常會對抗原的活性產(chǎn)生不同程度影響，為了保存細胞的超微結(jié)構(gòu)和抗原的活性，應通過預試驗，確定固定劑的種類、濃度、溫度、pH及固定時間和方式，可用已知效價的抗原進行試驗，選擇合適的固定方法。
??? 常用的免疫電鏡標本固定液
??? 多聚甲醛-戊二醛固定液（簡稱PG）：1％多聚甲醛對組織細胞的抗原性影響不大，若加入超過0.1％戊二醛，抗原性就會迅速減弱；當戊二醛的濃度低到0.01％～0.05％時，對抗原性的影響便不顯著，而細胞超微結(jié)構(gòu)的保存也可獲得很大改善。所以推薦用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作為免疫電鏡標本的固定劑，固定時間為4～5 h。對有些抗原性較強的標本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛進行固定。某些抗原對戊二醛極其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定會造成抗原提取或移位，同時醛類等交聯(lián)固定劑會改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)而影響其抗原性，所以在不明顯影響抗原性的前提下，選擇合適的固定濃度和時間，盡可能強一些為好。這里我們特別推薦使用美國EMS公司的多聚甲醛溶液和戊二醛溶液，常用貨號為157-8和16220。
??? 過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛混合固定液（簡稱PLP）：PLP液含0.01 mol/L過碘酸鈉、0.075mol/L賴氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸緩沖液。其機制是借助過碘酸鹽氧化抗原，一般為糖蛋白的糖類部分，使其羥基變?yōu)槿┗@樣賴氨酸的雙價氨基就能與醛基結(jié)合從而把抗原交聯(lián)起來。由于大多數(shù)組織抗原含蛋白質(zhì)與糖類，抗原決定簇位于蛋白部分，該固定劑有選擇性地固定糖類，這樣既穩(wěn)定了抗原，又不影響抗原決定簇與抗體的結(jié)合。加入低濃度的多聚甲醛則能穩(wěn)定蛋白與脂類。因為賴氨酸價格較貴，此固定液不如PG固定液經(jīng)濟。
??? 苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（簡稱PAPG）：PAPG液含4％多聚甲醛、15％（V/V）苦味酸、0.5％戊二醛、pH為7.3。苦味酸穿透迅速，可在不影響抗原活性的前提下固定蛋白質(zhì)，改善對膜和胞質(zhì)的保存。特別是不能采用高濃度的戊二醛與鋨酸做后固定時（如包埋后的免疫標記），在前固定液中加入苦味酸對超微結(jié)構(gòu)的保存有很大幫助。
??? 固定方法與時間
灌注固定：這是固定效果最好的方式，能使超微結(jié)構(gòu)得到很好的保存。以大鼠為例，麻醉后，用注射針頭經(jīng)左心室向主動脈灌注固定液，靜脈壓為120mm Hg柱，在5～15 min內(nèi)每200g體重灌注150 ml固定液。
?? 浸沒固定：將手術或灌注后切成的標本塊浸沒在固定液中固定，浸沒固定時間常為2～5h，游離細胞固定0.5～1h。
?? 包埋
?? 包埋劑類型：環(huán)氧樹脂包埋劑和低溫包埋劑。
?? 包埋前免疫標記：即對已固定的樣品先進行免疫標記，然后進行包埋、超薄切片并觀察結(jié)果，一般選用環(huán)氧樹脂包埋劑。環(huán)氧樹脂本質(zhì)是疏水性的，在包埋前樣品必須先進行完全脫水，然后在溫箱中進行熱聚合。熱聚合會使大多數(shù)抗原變性，因此該包埋劑不適用于包埋后免疫標記。
??? 包埋后免疫標記：指組織標本經(jīng)固定及樹脂包埋，制作成超薄切片后再進行免疫化學標記的方法，此方法多用低溫包埋劑，如Lowicryl系列包埋劑、LR White包埋劑和LRGold包埋劑。這三種包埋劑均能在低溫下（-35℃～-80℃）用紫外光（波長315～360nm）進行聚合，避免了高溫對抗原性的負面影響，提高了陽性標記率，而且對膠體金的非特異性吸附少，對溫度敏感的抗原應選擇使用低溫包埋劑。
??? 免疫標記
??? 根據(jù)免疫標記與標本包埋之間的不同關系，可分為包埋前免疫標記、包埋后免疫標記和不用包埋的冷凍超薄切片免疫標記。根據(jù)具體的標本、抗原的部位及性質(zhì)并結(jié)合實驗室的具體條件選擇恰當?shù)姆椒?。這三種免疫標記方法，都包括非特異性位點的封閉、抗體與抗原特異性結(jié)合的免疫反應、反應部位的示蹤顯示等基本步驟。
??? 包埋前免疫標記
??? 優(yōu)點一是切片在免疫標記前不經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋及高溫聚合的過程，抗原活性不會受到上述過程的影響，而且抗原暴露充分，標記的陽性率高，非特異性反應少。二是免疫標記后還可進行半薄切片，在免疫反應陽性部位做定位超薄切片，進一步提高電鏡的檢出率。三是免疫標記完畢后，用戊二醛與鋨酸再次固定組織，可使抗原抗體的結(jié)合更加牢固，并有利于膜結(jié)構(gòu)的保存。
??? 包埋前免疫標記主要用于細胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脫水劑和樹脂成分溶解和變性的抗原的檢測。包埋前免疫標記細胞內(nèi)抗原受到標記抗體的穿透性限制，為了提高對細胞內(nèi)抗原的標記率可以采取以下措施：
??? 厚切片
??? 厚切片進行包埋前免疫標記，需將固定后的組織厚切片（單細胞團不需厚切片），以利于標記抗體的穿透。厚切片的方法有以下幾種：
??? 冰凍切片：用恒冷箱冰凍切片機將固定后的組織塊切成8μm左右的厚片。將切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶內(nèi)備用。也有的將厚片直接貼在載玻片上進行免疫標記，這樣做雖然操作比較方便，但因抗體只能與厚片的一面接觸，所以會在一定程度上影響標記的陽性率。
??? 震動切片：震動切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫電鏡用只需20μm～80μm的切片。震動切片的優(yōu)點是可以避免冰凍對組織帶來的損害，但它切出來的切片過厚，即使在使用穿透劑的條件下，免疫試劑也僅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深層的組織就不易被標記。
增加細胞膜的通透性
??? 用0.01％Saponin或0.1％Triton X-100等活性劑處理5～8min，以增加細胞膜的通透性。但這些化學物質(zhì)會對超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定程度的破壞，所以應根據(jù)不同的組織或細胞，嚴格控制活性劑的應用濃度與時間。也可用凍融的方法增加細胞膜通透性，標本先進行防冰晶處理（厚片在含15％甘油、20％蔗糖的PBS中振搖沉底），在液氮中速凍0.5～1min后用PBS迅速回溫。
??? 選用相對分子質(zhì)量較小的標記物
辣根過氧化物酶與IgG的Fab片段交聯(lián)物，分子質(zhì)量較小，約100kD，較易進入細胞內(nèi)。也可用IgG Fab-lnm金作為標記物，標記后經(jīng)銀加強染色的納金包埋前標記法。由于該標記物較易穿透到組織和細胞內(nèi)，且定位比酶標抗體精確，因此被廣泛用于膜受體的精確定位。
??? 包埋后免疫標記?
??? 包埋后免疫標記具有超微結(jié)構(gòu)保存較好、方法簡便可靠、陽性結(jié)果重復性高的優(yōu)點，可對同一組織塊的連續(xù)切片做各種對照免疫標記，能十分準確地解釋免疫標記結(jié)果，而且還能在同一張切片上進行多重免疫標記，尤其適合于顆粒性標記物（膠體金標記）的免疫化學定位標記，是目前應用最廣的免疫電鏡技術。但是該方法也有明顯的缺點，抗原在脫水、浸透及樹脂包埋過程中可能被破壞，且抗原被樹脂遮蓋不易與抗體接觸，使免疫標記的陽性率下降。尤其是后固定劑鋨酸對抗原的破壞較嚴重，因此常常避免使用。為了得到精細的超微結(jié)構(gòu)并提高陽性標記率，必須注意以下幾個方面：
??? 通過預實驗確定合適的固定液，在保存抗原活性的前提下，也能得到較好的超微結(jié)構(gòu)。固定液一般不用四氧化鋨，因其會使抗原活性明顯降低。
??? 選用低溫包埋劑。
免疫電鏡用載網(wǎng)要選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)，而不用銅網(wǎng)，因銅網(wǎng)會與某些化學物質(zhì)產(chǎn)生反應而影響標記結(jié)果。
??? 冷凍超薄切片免疫標記?
??? 冷凍超薄切片免疫電鏡技術的特點是組織不經(jīng)脫水包埋直接冷凍，在冷凍狀態(tài)下進行超薄切片，然后進行免疫標記。該項技術克服了上述兩種方法的缺點，能更理想地保存一些生物大分子的活性，極大地提高了免疫標記的敏感性，但在冷凍過程中超微結(jié)構(gòu)會受到冰晶的破壞。1996年，LiouW等改良了冷凍超薄切片技術，用甲基纖維素和醋酸鈾混合液（含1.5％～2％甲基纖維素，0.3％～3％醋酸鈾的水溶液）代替?zhèn)鹘y(tǒng)的蔗糖溶液作為將冷凍切片從冷凍槽中轉(zhuǎn)移到鎳網(wǎng)上的溶液，得到了保存良好的超微結(jié)構(gòu)，使該項技術更加完美，應用也越來越廣泛。但該項技術必須有特殊的冷凍超薄切片機，且技術難度較高。
??? 對照實驗
??? 為了證實免疫標記結(jié)果的特異性，必須同時進行對照實驗。在抗體的特異性無問題的前提下，對照實驗有以下幾種：
??? 用未經(jīng)免疫的同種動物正常血清代替第一抗體，結(jié)果應為陰性。不加一抗，結(jié)果應為陰性。 用不含有靶抗原的標本進行免疫標記，結(jié)果應為陰性。 對肯定含有靶抗原的標本進行免疫標記，結(jié)果應為陽性。
??? 結(jié)果的觀察和解析
??? 在電鏡下觀察免疫標記的結(jié)果，通過標記物（膠體金、鐵蛋白或酶底物）顯示免疫反應部位以定位抗原的存在位置，注意區(qū)分特異性標記和背景的非特異性標記，進行正確的結(jié)果分析。
